AMARILLAMIENTO LETAL COCOTERO (ALC)

Introducción

El cultivo de cocoteros (Cocos nucifera, L) es de importancia económica, social y ecológica para la República Dominicana, Su producción genera divisas, empleos e ingresos, alimentos y otros subproductos para el mercado local e internacional. Además las palmas de cocos embellecen las playas de las principales zonas turísticas del país, proporcionándoles su belleza tropical al paisaje, y por consiguiente lo que incentiva la visita de turistas al país.

En Republica Dominicana, el área cultivada es de 22,491 ha. 359, 856 tas. Con una producción promedio anual de 2,227, 872.8, Unidades en las zonas costeras Este y Nordeste, (Secretaría de Estado de Agricultura, 2006). La producción de cocos frescos y subproductos se destina a los mercados nacionales e internacionales, generando este ultimo US$ 4, 553,143.00 Dólares, (CEI-RD, 2005) por concepto de las exportaciones.

En el año 2006 la República Dominicana recibió la visita de 2, 612,256 de turistas procedente de diferentes partes del mundo, generando el sector turístico la entrada de 3,750 dólares y mas de 300 mil empleos ( Martínez, 2006).

La enfermedad Amarillamiento Letal del Cocotero (ALC) es considerada como la más devastadora que afecta este cultivo, la cual ha matado cientos de miles de palmas en Key West, Florida, USA, desde el 1936.En el Caribe ha provocado la desaparición de este cultivo, destruyendo millones de palmas de coco durante los últimos 40 años, (OIRSA, 2002). El ALC es causada por un fitoplasma, transmitido por el insecto vector Myndus crudus Van Duzee, del orden Homóptera: Familia Cixiidae. (Howard, 1983).

El ALC ha sido reportada en La República Dominicana en varias ocasiones desde año 1962, afectando plantaciones domésticas en las localidades de la provincia de Puerto Plata, Santiago y Dajabón (Hichez, 1971). Recientemente fue reportado un brote en la localidad de Andrés, Boca Chica, Provincia Santo Domingo. (Martínez et al, 2007).

La detección de esta enfermedad es realizada mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa, (PCR), la cual es una técnica molecular que amplifica bandas de Ácido nucleicos.

Debido a que estos agentes patógenos no se pueden cultivar invitro, se recomienda su diagnóstico usando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la cual es una técnica molecular que amplifica bandas de acido nucleico. La PCR es recomendada para la detección de fitoplasmas y para la caracterización genética de estos. Conocer las razas del fitoplasma permitiría diseñar estrategias de manejo para prevenir la diseminación y daños de la enfermedad en las plantaciones comerciales.



I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1. Descripción y formulación del problema.

La enfermedad Amarillamiento Letal del Cocotero (ALC) ha sido reportada en República Dominicana, desde el año 1962; afectando plantaciones domésticas en las localidades de las provincias de Puerto Plata, Santiago y Dajabón. En cada aparición de la enfermedad han sido aplicada medidas como la tumba y quema de plantas enfermas para evitar la rápida dispersión de la misma (Hichez, 1971).

La aparición más reciente de ALC fue reportada en el año 2006 en las costa Sureste en la localidad de Andrés, Boca Chica, observándose un mayor número de plantas sintomáticas, que los reportados en los brotes ocurridos en años anteriores en la región Norte, (Martínez, comunicación personal 2006).

Esta enfermedad representa una potencial amenaza para lo producción de los cocoteros de la República Dominicana, ya que esta ha sido reportada como la mas devastadora del cultivo de palmas de cocos; Los síntomas iniciales se caracterizan por la caída prematura de los frutos de todo los tamaños, las hojas inferiores, intermedias y superiores se tornan amarillas, las inflorescencias y espátulas se necrosan; en la etapa final caen todas las hojas secas, quedando solo el tallo erecto (Córdova ,1995).

1.2 OBJETIVOS

1.2.1 Objetivo general:

Diagnóstico y caracterización de razas de fitoplasmas del amarillamiento letal del coco.


1.2.2 Objetivos específicos


a) Determinar la presencia del fitoplasma.

b) Diferenciación genética de las razas de Fitoplasmas presentes en el país.

c) Establecer la relación existente de los fitoplasmas encontrados en La República Dominicana con los de otros países.México, Honduras, Belice, Guatemala, USA (Florida), Jamaica, Cuba, Caimán y Haití.



1.3 – Justificación

Para la República Dominicana el cultivo de cocoteros es de gran importancia debido a que el mismo es utilizado en el sector agrícola y turístico, generando divisas para el pais, como parte de la exportación del producto, así como por concepto del turismo, atraído por el cocotero.
La producción de cocos frescos, rayado, deshidratado, y subproductos para la industria de cosmetología, alimentaría y medicinal se destina a mercados locales e internacionales, tanto de Estados Unidos, La Unión Europea, Canadá, Antillas Menores, Islas Vírgenes, Brasil, Puerto Rico, Haití y otros. La generación de divisas en el año 2005, por este concepto, alcanzaron un valor de US$ 2, 282, 987.80, Dólares. En el 2004 y US$ 4, 553,143.00, dólares (CEI-RD, 2005). Es de importancia señalar que A nivel nacional miles de familias dependen de este cultivo para su subsistencia.

Las palmas de cocos ubicadas en las playas de las principales zonas turísticas del país, proporcionan la belleza tropical al paisaje, lo que incentiva la visita de turistas. En el año 2006 la República Dominicana recibió la visita de 2,612,256 de turistas procedentes de diferentes partes del mundo, generando el sector turístico la entrada de 3,750 dólares. Mas de 300 mil. Empleos (Martínez, 2006).

Las oportunidades de negocios para Las Republica Dominicana están en desarrollo con las exportaciones, ya que Las Naciones de Norteamérica, Europa, Suramérica y el Caribe demandan mayor cantidad de coco fresco, procesado y una amplia variedad de subproductos. En la actualidad se ha retomado el uso del aceite de coco para usos culinarios, como aceite de coco virgen. En los Estados Unidos y Europa, el ½ litro se vende a US$16.00 y US$15.75, respectivamente. Esto representa una oportunidad para diversificar la producción e incrementar las divisas generadas por este cultivo (CEI-RD 2006).

1:4 Diagnostico y Caracterización
El diagnóstico y el conocimiento de la diversidad genética del agente patógeno existente en el país ayudaran a diseñar estrategias de manejo para prevenir la diseminación y daños de la enfermedad a las zonas de producción comercial. De manera que el conocimiento de las razas ayudará a diseñar estrategias de manejo para prevenir la diseminación y daños hacia plantaciones comerciales.

Esta investigación crearía las bases para la continuidad del cultivo y los beneficios que genera para más de 1500 productores de coco, procesadores, exportadores y otros miembros la República Dominicana de la cadena productiva así como también la entrada de divisas y fuentes de empleos de ambos sectores y la preservación del paisaje natural que le proporcionan las palmas de cocos a las playas del país. Creando las bases para que ambos sectores sean mas competitivos y sostenibles, principalmente en momentos de la apertura de nuevos mercados.

1.4 Alcance y limitaciones

1.4.1 Alcance
El estudio comprenderá las localidades de la zona Norte (Puerto Plata, Santiago, Dajabón) y Sureste (Andrés, Boca Chica) donde ha sido reportada la enfermedad y en las regiones de producción comercial Nordeste (Maria Trinidad Sánchez, Samaná) y Este (Hato Mayor, El Seibo, La Altagracia, La Romana) del país. Donde no se ha reportado. y para asegurar que estas zonas se encuentran libre de la enfermedad.

1.4.2 Limitaciones
Para determinar la secuencia de los pares de bases de los posibles fitoplasmas presentes en el país, será necesario enviarlas a centros internacionales que se dedican a esa actividad, ya que en la República Dominicana no existen las posibilidades para realizar esas técnicas.








11. MARCO TEÓRICO

2.1 Generalidades

Cocos nucifera L. (perteneciente a la familia Arecaceae), es conocido comúnmente como palma de coco. Probablemente sea nativa de las islas del pacifico, y hoy en día se cultiva en casi todos los trópicos.

Es la palmera más cultivada e importante del mundo, ya que actualmente es la principal especie productora de grasa vegetal. Es una de las plantas que proporciona una mayor diversidad de productos en el mundo, siendo una fuente primaria de alimento, bebida y de abrigo. La distribución de la palma de coco se extiende por la mayoría de las islas y de las costas tropicales y en algunos lugares fuera de la zona tropical.

El principal producto exportado es copra sin procesar seguido del coco deshidratado.
La diversidad y potencialidad del coco contribuye de manera considerable al sector económico de los países productores.

2.2 Antecedentes

El amarillamiento letal del coco (ALC) esta considerada como una de las enfermedades más importantes que afectan la producción de cocos, ha destruido los cocoteros hasta en un 100% en algunos países (Harries 1978). Es causada por un fitoplasma, Esta devastadora enfermedad se encuentra en México, Honduras, Belice, Guatemala, USA (Florida), Jamaica, Cuba, Gran Caimán, Haití y República Dominicana, (Beakbane et al 1972).

Muchos de estos países han tenido experiencias desastrosas como es el caso de Jamaica, donde el 100% de sus plantaciones fueron destruidos en un período de cuatro años, estimándose las pérdidas en cinco millones de palmas en un período de 20 años (Romney (1983). En Honduras ha destruido el 90% de los cocoteros (Plavsic-Banjac et al., 1972).

Es un organismo que tiene características similares a las bacterias, tiene citoplasma, ribosomas, ADN y está restringido a las células del floema. Es transmitido por insectos siendo uno de los mas importante Myndus crudus, Van Duzze (Homoptera: Cixidae), (Howard et al, 1983; Howard, 1995).

La dispersión del patógeno ocurre aparentemente a través de dos mecanismos, (McCoy et al 1983). Uno es mediante un centro localizado de infección, es decir, la enfermedad aparece en una o dos palmas y de ahí se extiende al azar a palmas contiguas. El segundo mecanismo de dispersión del ALC es a grandes distancias en forma discontinua, seguido por dispersión localizada. La distancia cubierta por estos saltos puede ser de decenas de kilómetros y son favorecidos por vientos fuertes como el de los huracanes. Por lo tanto el patógeno se puede dispersar muy rápido como ha ocurrido en México y en Honduras, (Córdova, 1995).

M. crudus se alimenta de plantas enfermas y luego se traslada a plantas sanas, diseminando así la enfermedad. Se cree que la grama ornamental utilizada para embellecer el entorno de las zonas turísticas es utilizada para su desarrollo (Piña, 1995). Se han reportado diferentes razas del fitoplasma causantes del amarillamiento letal del cocotero en el Caribe y en Africa, (Harrison et al.1994).

Los síntomas de ALC en el Caribe y África muestran similitud, pero se han observado diferencias en la epidemiología y en la susceptibilidad en los materiales, por lo que se asume que diferentes fitoplasmas causan la enfermedad. Los cocoteros y palmas susceptibles mueren rápidamente, en un período entre 4 y 6 meses desde la aparición de los primeros síntomas (Edén-Green, 1995)
.
Los síntomas de ALC observados en Puerto Plata, han sido confirmados por el Centro de Investigación Científica de Yucatán (CICY) de México, en colaboración con La Universidad de La Florida, de Los Estados Unidos, en muestras enviadas en el año 1997. Estas muestras se analizaron mediante la técnica de La Reacción en Cadena de la Polimerasa- PCR, las mismas resultaron positivas al ALC. Esta técnica ha sido. Usada para detectar el fitoplasma en el embrión del fruto. (Córdova, et al, 2003).

Esta enfermedad se había reportado desde hace mas de 40 años hasta el año 2006, siendo detectado y confirmado un nuevo brote en la costa Sur en la localidad de Boca Chica, (Martínez et al, 2007)


111. MATERIALES Y MÉTODOS.

3.1 Localización
El estudio abarcará las Regiones Norte (Puerto Plata, Dajabón) y Sur (Andrés Boca Chica) donde se ha reportado la enfermedad de plantaciones comerciales, en las regiones Nordeste (Maria Trinidad Sánchez, Samaná) y Este (Hato Mayor, El Seibo, La Altagracia y La Romana) de la República Dominicana, donde no se ha reportado la enfermedad. Con la finalidad de confirmar que la zona continúa libre de ALC.

3.2 Tipo de investigación.
Es una investigación descriptiva para detectar y caracterizar la variabilidad genética del fitoplasma del ALC de las palmas de coco en zonas afectadas por ALC.
3.3. Selección de plantas a muestrear.
En cada lugar donde se ha reportado la enfermedad se elegirán 5 plantas que presenten síntomas característicos de ALC y 5 plantas asintomaticas. En cada planta se tomaran muestras de hojas, troncos e inflorescencias para determinar la presencia o no del fitoplasma. En áreas libre de la enfermedad, se tomaran muestras de 10 plantas.

Se utilizará un receptor de Sistema de Posicionamiento Global (GPS) para marcar las zonas de incidencia, los puntos ubicados se utilizaran para construir un mapa de distribución de la enfermedad

3.4. Toma de muestras
Las muestras se tomaran de tronco hojas jóvenes e inflorescencias. Para la toma de muestra se escogerán con síntomas característicos de la etapa temprana de ALC. En el caso las inflorescencia, se cortarán cerrada la que está anterior a la inflorescencia abierta y las muestras de troncos se tomaran realizando un orificio de 10 a 12 cm. de profundidad, a una altura de1.0 a 1.5 metros del suelo mediante un taladro eléctrico.
Las muestras colectadas se pondrán en papel ligeramente húmedo y se depositara en una bolsa plástica previamente identificada. Luego serán colocadas en una hielera, para ser transportada al laboratorio.

3.3 Análisis de Laboratorio

Las muestras serán llevadas al laboratorio de Virología del Centro de Tecnologías Agrícolas (CENTA) del Instituto Dominicano de Investigaciones Agropecuarias y Forestales (IDIAF). Estas se analizaran mediante la técnica Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
En la investigación se realizaran tres tipos de análisis:
a) nested PCR para la detección de fitoplasmas.
b) Restriction fragments length polime (RFLPs), para la diferenciación de diversidad genética.
c) Secuenciación de las muestras seleccionadas.
El ADN de las muestras se amplificará utilizando iniciadores universales P1-P7 para determinar la presencia de fitoplasma en las muestras, luego se realizará con un PCR anidado con los iniciadores específicos LYSr y LY50F.

3.4 Detección del fitoplasma

El producto del PCR será fragmentado con electroforesis en un gel de Agarosa al 5% para analizar los patrones de las bandas obtenidas. Para la detección del fitoplasma. El producto obtenido del PCR será secuenciado para relacionar la similitud con otros fitoplasmas existentes en las regiones del área. La caracterización molecular de las razas, nos permitirá hacer comparaciones con los diferentes aislamientos del patógeno para determinar si existen diferentes razas del fitoplasma en la República Dominicana.




3.6 - Cronograma de actividades

Actividad E F M A M J J A S O N D E F M A M
Compra reactivos
Recolección de muestras x x x
Análisis de laboratorio x x x
Análisis de resultados X X
Presentación tesis
Publicación

















3.5 -Presupuesto Para realizar esta investigacion.

ITEM ARTICULO ESPECIFICACIONES UNIDADES CANTIDAD PRECIO UNIT VALOR RD $ Valor US $
1 Tubos eppendorf 0,5 µl Funda / 500 1 2000 2000 60.60
2 Tubos eppendorf 1,5 µl Funda / 500 1 2500 2500 75.75
3 Punta micropipetas 1-10 ul Funda / 1000 2 700 1400 42.42
4 Punta micropipetas 200-1000 ul Funda/ 1000 2 1200 2400 72.72
5 Guantes deshechables Mediano/largo Cajas/ 100 3 195 585 17.72
6 Iniciadores 24 bp 2 Vials/50 µl 2 3.910,51 7821,02 237.00
7 Taq polimerasa 250 unid/ µl 1 vials 2 4620 9240 280.00
8 dNTPs 10 mM dATP, dCTP, dGTP and dTTP Kit de 0.5 mL 1 5280 5280 160.00
9 PCR mix Set 1 4.780,00 4780 144.80
10 Nitrógeno liquido litros 4 170 680 20.60
11 Agarosa Grado PCR. Disolución Intermedia. Peso Molecular < 1000 bp. Sobre /100 gr 1 7755 7755 235.00
12 Fundas plásticas sellables 6x10/10x 14 Pulg Cajas/ 100 3 300 900 27.27
13 Binoculares 1 3500 3500 106.00
14 Sub-Total 48.841,02 1480.03
15 Gastos Operativos
16 Combustible 12 viajes/35 gl /Km Viajes 12 1770 21240 643.00
17 Viáticos 2 técnicos/Chofer 36 300 10800 327.27
18 Salario/día 1 Obrero toma de muestras de inflorescencia 8 200 1600 48.48
19 Elaboración e impresión Tesis 6.400,00 193.94
19 Sub-Total Gastos Op 40.040,00 1019.39
20 Sub-Total Gastos Op /Reactivos 88.881,02 2499.42
21 Imprevistos 10% 8888,102 249.90
22 Gran Total 97.769,12 2749.36


Nota:
Este es el presupuesto estimado, para realizar esa investigación, pero todavía no han llegado
al Centro de Tecnologías Agrícolas del IDIAF, los equipos de laboratorio donde se analizaran las muestras.en mexico yucatan es donde hay condiciones hasta el momento para la realización del mismo.






Bibliografía:

1 - Almeyda, Isidro, 1998.Diagnóstico molecular del Amarillamiento Letal del cocotero,
Centro de Investigación Regional del Sureste, Yucatán, México.
2- Beakbane, A.B., Slater, C.H. W. and Posnette, A.F.1972. Mycoplasmas in the phloem
of coconut, Cocos Nucifera L, with lethal yellowing disease. Journal of Horticulture
Science.


3- Centro de Exportación e Inversiones de la Republica Dominicana (CEI-RD), 2005
4- Cordova, I.1995.Estudiola distribucion intraplanta y dispersion del amarillamiento
letal en los cocoteeros mediante el uso de la Reccion en cadena de la polimerasa.
5- Eden-Green, S.J. 1995. Brief history of yellowing research. In: C. Oropeza., W.F.
Howard and GR. Absburner lethal yellowing research and practical aspects. pp. 17-33.

6- Harrison, N.A., Richardson, P.A., Kramer, J.B. and Tsai, J.H. 1994. Detection of
the Mycoplasmas-like organism associated with lethal yellowing disease of palm
in Florida by polymerase chain reaction Plant Pathology.
7- Harries, H.C.1978. Lethal yellowing disease of coconut in global perspective.
Philippines journal of coconut science. Florida, Estados Unidos
8- Howard, F.W., Norris, R.C. and Thomas, D.L. (1983). Evidence of transmission of palm lethal yellowing agents by a planthopper, Myndus crudus (Homptera: Cixiidae). Tropical Agriculture, Trinidad.
9- Howard, F.W. (1995). lethal yellowing vector study. Methods of experimental
transmission. In: C. Oropeza., W.F. Howard., and GR. Absburmer: lethal yellowing
research and practical aspects.

10- Hichez, E.1971. Amarillo Letal en la Republica Dominicana. Boletín No.3
Departamento de Sanidad Vegetal, Secretaria de estado de Agricultura.
11- Martinez, Desiré, 2006.Informe Asociacion Nacional de Hoteles y
Restaurantes.Listin Diario, 19 de marzo2006.
12-Secretaría de Estado de Agricultura, 2006. Diagnóstico del Sector Agropecuario, Subsecretaria de Planificación, Departamento de Economía Agropecuaria , Santo Domingo, Republica Dominicana.


11- Plavsic-Benjac, B., Hunt, P. and Maramorosch, K. (1972). Mycoplasm-like
bodies associated with lethal yellowing disease of coconut palm. Phytopathology, 62: 298-2- 12 - Romney, D.H. (1983). Brief review of coconut lethal yellowing. Indian coconut journal.

(Este es un trabajo de investigacion
hecho por la Ing.Andrea Felix)

.